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qPCR技術(shù)是分子生物實驗中，常見的一種幾首手段。使用Quantitative Real Time PCR擴(kuò)增裝置即qPCR儀，通過不同的化學(xué)原理和數(shù)學(xué)原理，在PCR過程中實時監(jiān)測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)。qPCR實現(xiàn)了通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。
qPCR的熒光標(biāo)記方法分為以添加熒光基團(tuán)核酸探針為主的熒光探針法，以綠色染料為主的熒光染料嵌合法。
利用不同化學(xué)原理設(shè)計的qPCR實驗，
實驗結(jié)果可能會產(chǎn)生不小的差距！
本期內(nèi)容，我們一起來聊聊這兩種常見的qPCR熒光標(biāo)記方法有何不同，幫助大家選擇更符合自身實驗需求的方法。
熒光探針法
簡單來說，應(yīng)用該原理的熒光探針，是由熒光基團(tuán)+DNA寡核苷酸+淬滅基團(tuán)構(gòu)成。
探針由5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)、目標(biāo)基因特異性結(jié)合的寡核苷酸序列以及3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)以及與組成。
自然狀態(tài)下，探針完整，熒光報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，儀器不會檢測到熒光信號。
當(dāng)存在目標(biāo)序列時，目標(biāo)DNA變性解鏈，熒光探針特異性結(jié)合到目標(biāo)基因處。引物也結(jié)合在目標(biāo)基因上，Taq酶又名DNA聚合酶，能將核苷酸添加到引物中，引物開始延伸。
Taq酶還具有5’-3’核酸外切酶活性。當(dāng)引物延伸至探針結(jié)合處，可將探針?biāo)猓篃晒鈭蟾婊鶊F(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，進(jìn)而被qPCR儀檢測到熒光信號，熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的DNA的濃度成正比。
熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴(kuò)增曲線"，通過熒光信號的強(qiáng)度反映出體系中雙鏈DNA的濃度。
熒光探針有許多不同種類，以應(yīng)對不同的實驗需求，該方法特異性高，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于基因檢測、病原體和病毒檢測、疾病耐藥基因篩查等領(lǐng)域。
德國MB支原體檢測試劑盒
Venor®Gem qEP
應(yīng)用熒光探針法對支原體DNA進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確率高，使用方便。
熒光染料嵌合法
該方法用到一種非特異性雙鏈DNA熒光染料，被激發(fā)后，顯示為綠色熒光。
該染料以一種非特異性方式，與雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區(qū)域相結(jié)合。游離的染料熒光信號微弱，在進(jìn)行qPCR擴(kuò)增生成dsDNA時，染料逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號被很大程度放大，熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比。
熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴(kuò)增曲線"，通過熒光信號的強(qiáng)度反映出體系中dsDNA的濃度。
德國MB支原體qPCR檢測試劑盒，應(yīng)用熒光探針法原理，對支原體DNA進(jìn)行檢測，具有特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、可重復(fù)性更佳的特點。
支原體檢測方面，通過歐洲藥典和日本藥典方法學(xué)檢驗。
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