為確定有無支原體污染該做哪些檢測？

更新時間：2021-10-15 | 點(diǎn)擊率：942

為確定有無支原體污染可做如下檢測：

1.相差顯微境檢測

將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。

2.熒光染色法

熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗，置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1-2min，向細(xì)胞面滴加pH5．5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。

3.電鏡檢查

用掃描電鏡方法簡便快速，也可以利用透射電鏡。

4.DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法

檢出率高，但方法較為復(fù)雜。

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小一般在0.3-0.5μm之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細(xì)胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細(xì)胞培養(yǎng)中生長，營養(yǎng)要求比細(xì)菌高。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)和器材要保證無菌；在細(xì)胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

1、支原體檢測

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點(diǎn)：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒（均為探針法檢測），依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別，

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。

2、環(huán)境空間消毒方案

試驗(yàn)臺、超凈臺、培養(yǎng)箱、液氮罐、移液器、門把手、電話等細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

被支原體污染，可引起細(xì)胞的污染。應(yīng)定期對工作區(qū)域進(jìn)行消毒。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

截圖20211015090715.png

qPCR法介紹：