「支原體qPCR檢測」的方法學(xué)驗證

更新時間：2020-12-28 | 點(diǎn)擊率：1209

在生物制品和細(xì)胞治療領(lǐng)域，支原體檢查是保證產(chǎn)品和治療安全的重要一環(huán)。生物源性原材料、采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體，以及細(xì)胞或基因治療產(chǎn)品在生產(chǎn)過程的不同階段都要進(jìn)行支原體污染的檢查。

傳統(tǒng)支原體檢查方法是培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法，并為藥典所認(rèn)可和收錄。近年來，『支原體qPCR檢測』在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，但在項目申報前，先需要進(jìn)行方法學(xué)驗證，依據(jù)藥典，在檢測限、特異性和耐用性方面達(dá)到要求后，才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。

就筆者所知，在適合工業(yè)的支原體檢測和方法驗證方面，德國Minerva Biolabs（簡稱MB）公司已有很成熟的產(chǎn)品及商業(yè)化應(yīng)用，它不僅提供有符合藥典的『支原體qPCR檢測』試劑盒，而且有一系列支原體標(biāo)準(zhǔn)品及輔助產(chǎn)品，用于qPCR方法的全面驗證。這些產(chǎn)品性價比也較高，許多客戶都在使用。

下面，筆者就『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』的方法驗證產(chǎn)品闡述如下。

一、『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求

各國藥典對支原體核酸擴(kuò)增檢測方法（簡稱NAT法）的驗證要求略有出入，但均要求對檢出限、特異性和耐用性進(jìn)行驗證。在檢測方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進(jìn)行支原體檢測。

如使用商品化試劑盒，則除了需要試劑盒生產(chǎn)商提供完整的方法學(xué)驗證數(shù)據(jù)外，還需要使用者驗證試劑盒對其樣本的適用性，以及試劑盒表現(xiàn)出預(yù)期的性能（例如檢測限、耐用性、是否存在與細(xì)菌的交叉反應(yīng)）。這些必須由使用者自己來證明。

在檢出限驗證中，歐洲藥典（簡稱EP）規(guī)定了污染細(xì)胞的常見9種支原體，要求NAT如替代培養(yǎng)法，對這9種支原體的檢測限需均達(dá)到10CFU/ml。其中如果生產(chǎn)中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關(guān)節(jié)液支原體（M. synoviae）。

日本藥典（簡稱JP）中的驗證要求與EP基本一致，但在檢出限驗證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗證。

終待驗證的支原體物種的選擇，在依據(jù)藥典基礎(chǔ)上，還需根據(jù)支原體污染風(fēng)險大小而定。污染風(fēng)險的影響因素有支原體寄生的宿主細(xì)胞的特異性、原材料的來源、產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域等。

德國MB公司提供有10CFUTM支原體高敏標(biāo)準(zhǔn)品，可同時用于檢測限和耐用性的驗證。